外顯子組測序，是利用序列捕獲技術，將全基因組外顯子區(qū)域的DNA捕捉并富集后，進行高通量測序的基因組分析方法。在同樣的測序通量下，外顯子組測序針對目標區(qū)段的測序深度以及覆蓋度都高于全基因組重測序，因此該技術對于發(fā)生在外顯子區(qū)的常見和罕見的染色體變異具有很高的檢測靈敏度。其簡便、經濟、高效等特點，使其成為近年的熱門技術。

一、 捕獲平臺

Agilent SureSelect捕獲系統(tǒng)

      Agilent SureSelect Human All Exon V6人全外顯子捕獲系統(tǒng)，依托液相捕獲系統(tǒng)，采用120-mer的RNA作為“誘餌”探針，能夠高效地捕獲帶有SNV，InDel等突變的基因組序列。目前，該技術廣泛應用于癌癥等復雜疾病相關的遺傳變異研究中，并獲得了國際癌癥協(xié)會（ICGC）的鑒定認可。

SureSelect 人全外顯子 V6 高度優(yōu)化的捕獲探針設計結合嚴格的捕獲工作流程，獲得的高的在靶效率能夠確保讀出序列對靶標的特異性映射，從而實現深度覆蓋。此外顯子組靶向包括難捕獲區(qū)域的相關數據庫的更新內容，可實現蛋白質編碼區(qū)域的全面分析。

技術優(yōu)勢

1. 最全面的內容，適用于任何應用的外顯子組解決方案

• 包含相關數據庫的最新核心內容，可靶向包括難捕獲區(qū)域在內的更多外顯子
•  輕松添加用于轉化研究的 UTR、用于癌癥研究的 COSMIC，或用于特定應用的定制內容

2. 高覆蓋率、高深度測序，可準確的檢測出疾病相關的常見及稀有變異

二、 技術參數

• 樣品要求

         樣本類型：DNA樣品
         樣品濃度：≥50ng/μl
         樣品總量：≥2ug 

• 建議測序深度

         1、 Germline變異相關建議測序深度80X以上（單基因/復雜疾病研究）
         2、 Somatic變異相關建議測序深度150X以上（腫瘤癌癥研究）

• 項目周期

         測序實驗及基礎分析：35個工作日
 

三、 技術路線

四、 數據分析結果展示

a) 突變頻率分布圖

圖中展示了其中一個樣本在24條染色體上每兆（Mbp）區(qū)域類突變頻率分布，可以直觀看出該樣本在染色體上那些區(qū)域突變集中。綠色和紅色的是表示所有突變的頻率，其中紅色的表示在這1M區(qū)域內，target區(qū)域（試劑捕獲區(qū)域以及上下游25bp）小于500bp，藍色表示的是exonic上的突變頻率。

b) 突變功能分布圖

圖中展示了其中一個樣本突變功能分布情況。上方的餅圖表示在基因不同區(qū)域上(intron, exon, etc.)的變異所占的百分比；下方的餅圖表示在exon位置上不同變異類型所占的百分比。

c) 樣本拷貝數變異區(qū)間圖

其中右上角標注樣本名，圖中灰色的線條橫坐標是染色體位置坐標，縱坐標是平覆蓋度的z-score歸一化值，每折點是一個小的捕獲區(qū)間?；疑€條是參考對照的樣本的歸一化值變化情況，紅色或綠色代表該樣本的歸一化值變化情況，其中紅色表示DEL，綠色表示DUL。

d) 體細胞突變率及突變頻譜圖

圖形上方展示每對樣本體細胞突變數目，下圖展示每對樣本體細胞突變不同突變類型所占的比例。

e) 樣本體細胞突變heatmap圖

 

f) 體細胞突變富集分析圖

左邊縱坐標表示Go term，橫坐標是富集因子（Rich Factor = Gene number/Total Gene Number of the term）。每個圓圈的大小與在這個Go Term上的基因成正比，顏色與根據q-value的log值從紅到綠漸變，越紅，q-value值越低，富集越顯著。

g) 家系連鎖分析LOD連鎖圖及單倍型圖

左圖為LOD連鎖圖，通常，LOD值≥3被認為是兩個基因連鎖得確定證據（因為LOD值是以10為底的對數計算的，LOD值為3表明1000：1的機會，即所觀察到的連鎖不是偶然發(fā)生的）；LOD值≥2時，可能連鎖；-2<LOD值<2時，需要更多地家系資料，尚不能判別是否連鎖；LOD值<-2時，為不連鎖；右圖為致病位點單倍型圖，可以根據此圖判斷致病位點是否在家系患病成員中處于共分離狀態(tài)。

h) 曼哈頓圖(Manhattan Plot)

X-軸為基因組坐標，Y-軸為每個單核苷酸多態(tài)性的關聯(lián)P-值的負對數。

五、 研究方案 

• 基于全外顯子組測序的孟德爾遺傳疾病研究方案
• 基于全外顯子組測序的復雜疾病研究方案
• 基于全外顯子組測序的腫瘤驅動基因研究方案

單位介紹

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