環(huán)形RNA是mRNA在剪接的過(guò)程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。 近來(lái)的研究表明，高等動(dòng)物中環(huán)狀RNA的種類(lèi)和含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)預(yù)期。最近的研究發(fā)現(xiàn)circularRNA可以作為“microRNA海綿”，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合microRNA從而解除這些microRNA對(duì)其他靶標(biāo)的調(diào)控；同時(shí)保守型分析發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA上潛在具有多種RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，暗示circular RNA可以調(diào)控RNA結(jié)合蛋白的功能。更為重要的是，circular RNA的表達(dá)呈現(xiàn)出很強(qiáng)的組織特異性，暗示這些circular RNA具有重要的生物學(xué)功能。但目前對(duì)circular RNA的研究剛剛起步，這類(lèi)RNA的生物學(xué)功能還有待挖掘，因此是一個(gè)值得深入的研究方向。

 環(huán)狀RNA特點(diǎn)

1. 大多存在于細(xì)胞質(zhì)中，且序列高度保守； 
2. 一般細(xì)胞或組織中，環(huán)狀RNA較穩(wěn)定，半衰期在48h，其他mRNA（線(xiàn)性）半衰期約為10h。 
3. 不同細(xì)胞中表達(dá)的環(huán)狀RNA可能不同； 
4. 同一個(gè)基因可能即產(chǎn)生線(xiàn)性mRNA，又可以轉(zhuǎn)錄成環(huán)狀RNA;
5. 總量估計(jì)，外顯子環(huán)狀RNA（exonic circRNA）的量約為polyA mRNA（線(xiàn)性mRNA）的1%；占所有非核糖體RNA的0.8%； 
6. 大部分為ncRNA。 

樣本要求

• 樣本類(lèi)型：細(xì)胞、新鮮組織或足量total RNA
• 樣品量：≥5ug純化后的total RNA（需保證提供的細(xì)胞及組織樣本可以提取到足量RNA），最低濃度不低于50ng/μl
• 樣本質(zhì)量：OD 260/280值應(yīng)在1.9～2.2 之間；DNA 應(yīng)該去除干凈，RNA無(wú)降解；RIN值大于等于7
• 樣品保存運(yùn)輸：RNA用離心管保存，封口膜封口后用干冰運(yùn)輸，組織樣品則用凍存管保存，干冰或液氮運(yùn)輸 

實(shí)驗(yàn)流程

 

檢測(cè)原理

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)circRNA最關(guān)鍵的原理是尋找反向剪接的reads，即back-splicing reads。

數(shù)據(jù)分析

分析結(jié)果

1. circRNA預(yù)測(cè)及數(shù)目統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Memczak等[1]的方法進(jìn)行circRNA的預(yù)測(cè)。每個(gè)樣本mapping到基因組各個(gè)染色體的reads以及back-splicing reads可以通過(guò)圈圖展示。

圖1. 基因組覆蓋分布圖。

以1K的窗口得出基因組的一個(gè)覆蓋分布，圖中最外圈為基因組，里面每一個(gè)圈表示一個(gè)樣本的染色體reads覆蓋，其中紅色代表該樣本中back-splicing reads的覆蓋情況。

對(duì)所有預(yù)測(cè)獲得的circRNA與circBase數(shù)據(jù)庫(kù)[2]的已知circRNA的位置信息進(jìn)行比較，可以區(qū)分出新預(yù)測(cè)出來(lái)的novel circRNA和已知的known circRNA，統(tǒng)計(jì)如下：

2. circRNA表達(dá)定量及差異分析

目前，對(duì)于絕大多數(shù)的circRNA而言都無(wú)法獲得其完整的序列[3]，因此只能用circRNA的back-splicing位點(diǎn)處的junction reads來(lái)計(jì)算其表達(dá)量，這里我們采用SRPBM [4]對(duì)reads進(jìn)行歸一化處理。用edgeR [5]軟件計(jì)算篩選差異表達(dá)的circRNA，得出p-value后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制FDR（False Discovery Rate）來(lái)決定p-value的閾值，校正后的p-value即q-value。

圖2. circRNA差異表達(dá)散點(diǎn)圖和火山圖

3. circRNA關(guān)聯(lián)基因的GO和KEGG富集分析

根據(jù)circRNA的位置信息，可以獲得與circRNA所在基因組位置上相關(guān)聯(lián)的蛋白編碼基因，然后我們對(duì)差異circRNA所對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

圖3. circRNA關(guān)聯(lián)基因的GO富集散點(diǎn)圖

圖4. circRNA關(guān)聯(lián)基因的KEGG富集散點(diǎn)圖

4. circRNA-miRNA靶向預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用miRanda軟件[6]預(yù)測(cè)差異表達(dá)circRNA與miRNA的靶向結(jié)合關(guān)系，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

圖5. circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

單位介紹

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