環(huán)形RNA是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀RNA分子。 近來的研究表明，高等動物中環(huán)狀RNA的種類和含量遠遠超過預期。最近的研究發(fā)現(xiàn)circularRNA可以作為“microRNA海綿”，競爭結合microRNA從而解除這些microRNA對其他靶標的調控；同時保守型分析發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA上潛在具有多種RNA結合蛋白的結合位點，暗示circular RNA可以調控RNA結合蛋白的功能。更為重要的是，circular RNA的表達呈現(xiàn)出很強的組織特異性，暗示這些circular RNA具有重要的生物學功能。但目前對circular RNA的研究剛剛起步，這類RNA的生物學功能還有待挖掘，因此是一個值得深入的研究方向。

 環(huán)狀RNA特點

1. 大多存在于細胞質中，且序列高度保守； 
2. 一般細胞或組織中，環(huán)狀RNA較穩(wěn)定，半衰期在48h，其他mRNA（線性）半衰期約為10h。 
3. 不同細胞中表達的環(huán)狀RNA可能不同； 
4. 同一個基因可能即產生線性mRNA，又可以轉錄成環(huán)狀RNA;
5. 總量估計，外顯子環(huán)狀RNA（exonic circRNA）的量約為polyA mRNA（線性mRNA）的1%；占所有非核糖體RNA的0.8%； 
6. 大部分為ncRNA。 

樣本要求

• 樣本類型：細胞、新鮮組織或足量total RNA
• 樣品量：≥5ug純化后的total RNA（需保證提供的細胞及組織樣本可以提取到足量RNA），最低濃度不低于50ng/μl
• 樣本質量：OD 260/280值應在1.9～2.2 之間；DNA 應該去除干凈，RNA無降解；RIN值大于等于7
• 樣品保存運輸：RNA用離心管保存，封口膜封口后用干冰運輸，組織樣品則用凍存管保存，干冰或液氮運輸 

實驗流程

 

檢測原理

通過高通量測序技術檢測circRNA最關鍵的原理是尋找反向剪接的reads，即back-splicing reads。

數(shù)據(jù)分析

分析結果

1. circRNA預測及數(shù)目統(tǒng)計

應用Memczak等[1]的方法進行circRNA的預測。每個樣本mapping到基因組各個染色體的reads以及back-splicing reads可以通過圈圖展示。

圖1. 基因組覆蓋分布圖。

以1K的窗口得出基因組的一個覆蓋分布，圖中最外圈為基因組，里面每一個圈表示一個樣本的染色體reads覆蓋，其中紅色代表該樣本中back-splicing reads的覆蓋情況。

對所有預測獲得的circRNA與circBase數(shù)據(jù)庫[2]的已知circRNA的位置信息進行比較，可以區(qū)分出新預測出來的novel circRNA和已知的known circRNA，統(tǒng)計如下：

2. circRNA表達定量及差異分析

目前，對于絕大多數(shù)的circRNA而言都無法獲得其完整的序列[3]，因此只能用circRNA的back-splicing位點處的junction reads來計算其表達量，這里我們采用SRPBM [4]對reads進行歸一化處理。用edgeR [5]軟件計算篩選差異表達的circRNA，得出p-value后進行多重假設檢驗校正，通過控制FDR（False Discovery Rate）來決定p-value的閾值，校正后的p-value即q-value。

圖2. circRNA差異表達散點圖和火山圖

3. circRNA關聯(lián)基因的GO和KEGG富集分析

根據(jù)circRNA的位置信息，可以獲得與circRNA所在基因組位置上相關聯(lián)的蛋白編碼基因，然后我們對差異circRNA所對應的基因進行GO和KEGG富集分析。

圖3. circRNA關聯(lián)基因的GO富集散點圖

圖4. circRNA關聯(lián)基因的KEGG富集散點圖

4. circRNA-miRNA靶向預測及網(wǎng)絡構建

用miRanda軟件[6]預測差異表達circRNA與miRNA的靶向結合關系，并繪制網(wǎng)絡圖。

圖5. circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡圖

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