一、 甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序概述

甲基化DNA 免疫共沉淀測(cè)序（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing， MeDIP-Seq）先用5'-甲基胞嘧啶抗體富集胞嘧啶甲基化的基因組片斷，然后對(duì)富集的片段進(jìn)行高通量測(cè)序。該方法檢測(cè)范圍覆蓋全基因組，所需測(cè)序數(shù)據(jù)量較少，但不能在單堿基分辨率水平上檢測(cè)DNA胞嘧啶甲基化狀態(tài)。

二、 甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序研究?jī)?nèi)容

• 全基因組不同水平甲基化區(qū)域的分布：分析MeDIP-Seq 讀序在全基因組、不同功能元件區(qū)域（CpG 島、重復(fù)序列、啟動(dòng)子、非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子和基因間等）的分布情況。識(shí)別序列富集峰（peak）。結(jié)果可顯示不同樣本間DNA甲基化修飾模式的差異。
• 基于富集峰的基因功能及其調(diào)控機(jī)制的預(yù)測(cè)：對(duì)于單個(gè)樣本，分析與peak相關(guān)的基因；對(duì)于多樣本，進(jìn)行基于peak 的全基因組甲基化差異分析。通過(guò)分析差異甲基化區(qū)段（DMR），對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析及pathway功能分析；也可結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)受甲基化調(diào)控的基因。

研究流程示例

三、 甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序?qū)嶒?yàn)技術(shù)路線

MeDIP-Seq實(shí)驗(yàn)流程

四、 樣品要求（基因組DNA）

樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0 之間；RNA 應(yīng)去除干凈。
樣品濃度：最低濃度不低于50ng/ul。
樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于10ug。
樣品溶劑：溶解在H20或TE (pH 8.0)中。
樣品運(yùn)輸：DNA低溫運(yùn)輸（-20℃）；且在運(yùn)輸過(guò)程中請(qǐng)用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。

五、 甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序數(shù)據(jù)分析流程

六、 MeDIP-Seq數(shù)據(jù)分析內(nèi)容

1. 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

包括：總reads數(shù)、總base數(shù)，Q20比例、Q20位點(diǎn)分布圖。

2. 測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)處理

包括：去除總體質(zhì)量偏低的reads，將質(zhì)量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端質(zhì)量Q低于20的堿基；去除reads中所含有的接頭序列；去除長(zhǎng)度小于20的測(cè)序片段(reads)。

3. 將預(yù)處理后的reads比對(duì)到參考基因組并統(tǒng)計(jì)富集效率

包括：Reads唯一比對(duì)率，在CpG島區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域及整個(gè)基因組的覆蓋及不同深度關(guān)系

4. 測(cè)序深度是否足夠質(zhì)量控制

5. 甲基化富集效果質(zhì)量控制

 

6. Peak查找和統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用MACS軟件對(duì)基因組mapping得到的bam文件進(jìn)行peak 富集區(qū)查找，并統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度和染色體分布。

7. Peak在CpG島、不同基因功能元件中的分布

  

8. 基于peak的樣本間差異分析

將各樣本有重疊的peak合并，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本在合并后的peak中是否富集，統(tǒng)計(jì)組間差異的個(gè)數(shù)并基于RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)計(jì)算peak在組間差異是否顯著。

9. 樣本間富集程度相關(guān)性分析

 
10. 樣本間差異peak區(qū)域測(cè)序深度作圖

 
11. 全基因組甲基化圖譜

 對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析及pathway功能分析

12. 對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析及pathway功能分析

GO功能分析：

 
KEGG功能分析：

 

13. MeDIP-seq數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析

將MeDIP-seq數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析，對(duì)富集peak區(qū)域和差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可進(jìn)行差異基因的甲基化情況聚類熱圖、不同基因區(qū)域甲基化和表達(dá)譜相關(guān)性計(jì)算和作圖。

14. 客戶定制分析 

可根據(jù)客戶的研究需求，協(xié)商定制個(gè)性化分析內(nèi)容。

MeDIP-Sequencing應(yīng)用案例

• PNAS：研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A突變驅(qū)動(dòng)了慢性粒單核細(xì)胞白血病

在20%的急性髓性白血病案例中會(huì)發(fā)生DNMT3A的突變，突變熱點(diǎn)為Arg882 (R882)。本研究通過(guò)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及骨髓移植（BMT）的方法來(lái)研究DNMT3A-Arg882His (R882H)突變體的轉(zhuǎn)化能力。研究人員發(fā)現(xiàn)突變的基因能夠引起造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的異常增殖。BMT 1年后，所有小鼠都出現(xiàn)了血小板增多，且患上CMML。RNA芯片分析結(jié)果顯示一些造血作用相關(guān)基因異常表達(dá)，DNA甲基化實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因區(qū)域甲基化類型發(fā)生相應(yīng)的變化（課題相關(guān)MeDIP-SEQ技術(shù)服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）。此外，DNMT3A-R882H增加了CDK1蛋白水平，加強(qiáng)了細(xì)胞周期活力，這些都導(dǎo)致白血病的生成。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的陳竺院士、陳賽娟院士以及王月英博士是這篇論文的共同通訊作者。 

原文：DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Feb 4.

單位介紹

•        上海伯豪生物技術(shù)有限公司（Shanghai Biotechnology Corporation）是上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心根據(jù)國(guó)內(nèi)外研發(fā)外包發(fā)展的需要，整合旗下系統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)、商業(yè)化服務(wù)體系、高素質(zhì)服務(wù)團(tuán)隊(duì)等資源成立的致力于研發(fā)外包服務(wù)的專業(yè)化公司。

  上海伯豪生物技術(shù)有限公司擁有六大服務(wù)平臺(tái)：生物樣品分析平臺(tái)、微陣列芯片平臺(tái)、新一代測(cè)序平臺(tái)、生物標(biāo)志物平臺(tái)、分子檢測(cè)平臺(tái)、生物信息平臺(tái)，憑借高標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)平臺(tái)和多樣化的服務(wù)等競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，公司向國(guó)內(nèi)外企業(yè)和相關(guān)單位提供系統(tǒng)的生物學(xué)研究全面解決方案。目前正在為多達(dá)18家跨國(guó)制藥企業(yè)（包括排名前10位的跨國(guó)制藥企業(yè)）和超過(guò)3000家的國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)、醫(yī)院等提供基因表達(dá)譜、基因分型、比較基因組學(xué)、DNA甲基化、miRNA、生物標(biāo)志物篩選及確認(rèn)、生物信息等技術(shù)服務(wù)。 

  公司擁有一支以上海為基礎(chǔ)，輻射全國(guó)的強(qiáng)大市場(chǎng)營(yíng)銷隊(duì)伍和銷售網(wǎng)絡(luò)，已設(shè)立華北、華南、華東三個(gè)大區(qū)十五個(gè)辦事處，推廣公司的主導(dǎo)技術(shù)服務(wù)、代理產(chǎn)品，快速提升公司品牌的知名度，擴(kuò)大影響力。過(guò)去10年承接項(xiàng)目數(shù)超過(guò)10000個(gè)，用戶單位3000家以上，協(xié)助客戶發(fā)表SCI論文700余篇（影響因子共計(jì)3000多分），全面推動(dòng)了中國(guó)基因組學(xué)服務(wù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 

  公司建立了規(guī)?；馁|(zhì)量控制體系，通過(guò)了ISO9001: 2008質(zhì)量技術(shù)體系的認(rèn)證，并參照GLP-L的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)128個(gè)SOP文件對(duì)項(xiàng)目、樣品、實(shí)驗(yàn)過(guò)程、生物信息分析過(guò)程、數(shù)據(jù)信息管理、保密等進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。尤其是數(shù)據(jù)管理，做到異地備份，保密管理。為用戶的數(shù)據(jù)真實(shí)性、可靠性提供了保證。

  公司的系統(tǒng)化技術(shù)平臺(tái)和高質(zhì)量的服務(wù)體系得到了廣大客戶認(rèn)可和合作伙伴的高度評(píng)價(jià)。公司平臺(tái)陸續(xù)獲得了國(guó)際知名高通量技術(shù)廠商Illumina、Affymetrix、Agilent、ABI的技術(shù)服務(wù)中心認(rèn)證。公司于2012年獲得諾華（CNIBR）優(yōu)秀供應(yīng)商獎(jiǎng)（Supplier Award 2012）。公司是Affymetrix公司在中國(guó)第一家認(rèn)證的服務(wù)提供商，是Agilent公司在國(guó)內(nèi)唯一認(rèn)證的服務(wù)提供商，先后被授予“Agilent公司亞太區(qū)最佳服務(wù)供應(yīng)商”和“Affymetrix公司優(yōu)秀服務(wù)商”稱號(hào)。

  
  

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